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Resumo

A anemia falciforme é uma doença genética hereditária, na qual ocorre uma alteração na hemoglobina, proteína que carrega o oxigênio do sangue aos tecidos, que leva à  alteração  no formato das hemácias – as células vermelhas do sangue, onde se localiza a hemoglobina – originalmente em formato de disco para um formato similar ao de uma foice. Os pacientes apresentam complicações como dores ósseas frequentes, infecções, acidente vascular cerebral e vivem menos que a população geral. Além disso, são frequentemente hospitalizados e recebem muitas transfusões de sangue, aumentando o uso de recursos do sistema de saúde. 

Segundo o Ministério da Saúde, estima-se que 60 a 100 mil brasileiros convivam com a doença. Em sua maioria, essas pessoas dependem exclusivamente do SUS para o tratamento. 

Atualmente, a única terapia disponível para a doença é o transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas (que fabricam as células do sangue), realizado com células de um doador saudável. Contudo, a falta de doadores compatíveis limita seu uso. Por isso, são necessárias novas alternativas para a melhora da qualidade de vida desses pacientes.

A terapia gênica é potencialmente curativa para a anemia falciforme e não apresenta algumas das complicações do transplante alogênico, o que justifica o seu desenvolvimento. Neste contexto, a tecnologia de edição gênica CRISPR/Cas9 é uma alternativa que, apesar de ainda exigir um aprimoramento, merece destaque. 

Diante desse cenário, o objetivo principal deste projeto é desenvolver ferramentas e expertise em CRISPR/Cas9 para a correção do defeito genético causador da anemia falciforme. Serão utilizados modelos in vitro e in vivo para análise da eficiência da correção do alelo mutado e da consequente geração de células-tronco capazes de gerar eritrócitos saudáveis.

Introdução

O projeto busca adquirir e aprimorar a técnica de terapia gênica para garantir um tratamento potencialmente curativo aos pacientes com anemia falciforme que não têm um doador de células-tronco para o transplante alogênico. A ideia é que eles tenham, portanto, acesso a um tratamento que não é limitado pela falta de doadores , capaz de interromper a progressão da doença, aumentar a expectativa de vida e diminuir custos relacionados às complicações clínicas.

A correção da mutação causada pela anemia falciforme é realizada diretamente no DNA de células-tronco do paciente: elas serão coletadas, submetidas à modificação genética e reinfundidas no indivíduo. A vantagem das células serem autólogas, ou seja, do próprio paciente, é que isto elimina alguns dos problemas relacionados ao transplante alogênico, como a rejeição.

Na técnica CRISPR-CAS9, uma proteína guiada por um RNA específico corta a fita de DNA especificamente no local da mutação da anemia falciforme . Em seguida, a correção utiliza um molde de DNA contendo a sequência do gene capaz de gerar hemoglobina saudável. Faz parte dos objetivos adquirir, dominar e aperfeiçoar essa técnica,, o que permitirá seu uso em pacientes no futuro.

Métodos

A iniciativa baseia-se na metodologia de correção das células-tronco e transplante autólogo. Nesta técnica, as células-tronco são coletadas do sangue do paciente e enviadas ao laboratório, onde serão submetidas à correção genética, e transplantadas no próprio paciente. As células-tronco corrigidas darão origem a hemácias saudáveis, que não obstruirão os vasos sanguíneos do indivíduo, deixando-os livres das complicações da doença. 

A pesquisa está, atualmente, na fase pré-clínica de desenvolvimento e validação de protocolos. Após os resultados dos testes, será possível validar a segurança e eficácia da estratégia para que, em seguida, sejam incluídos pacientes no estudo.

 

Edição gênica com CRISPR/Cas9:

Será utilizado um single guide RNA sintético, que tem como alvo a região da mutação pontual no éxon 1 do gene HBB em complexo com uma ribonucleoproteína (RNP) Cas9 de alta fidelidade. O complexo RNP Cas9-sgRNA será nucleoporado em células-tronco hematopoiéticas (CTPH), e a sequência contendo a região de homologia para reparo será inserida via transdução de um vírus adeno-associado (rAAV6).

 

Validação da correção e funcionalidade celular:

A eficiência da edição e a integridade funcional das células editadas serão investigadas por: 

  • Frequência de inserções ou deleções (indels) no locus HBB; 
  • Identificação de erros (off-targets) na edição genômica do gene HBB; 
  • Avaliação do potencial de diferenciação nas diferentes linhagens hematopoiéticas por meio de ensaio de formação de colônias (CFU) em metilcelulose ou em co-cultivo com células estromais; 
  • Análise da frequência de correção da mutação p.E6V por PCR digital; 
  • Análise do potencial de diferenciação das CTPH in vitro; 
  • Análise da expressão de globinas (genes/proteínas) em eritrócitos diferenciados de pacientes com anemia falciforme.

    •  

    Avaliação do potencial de reconstituição da medula óssea:

    CTPH CD34+ editadas serão transplantadas em modelos in vivo para validação de seu potencial de reconstituir a medula óssea e de produzir células sanguíneas diferenciadas em pelo menos duas linhagens hematopoiéticas in vivo. Para isso, amostras serão obtidas dos modelos e analisadas por citometria de fluxo para detecção de marcadores de linhagens hematopoiéticas humanas. Além disso, será analisado o estado do tetrâmero de hemoglobina no modelo in vivo por meio de cromatografia líquida de alta performance.

    Equipe

    Indicadores

    12
    Quantidade de profissionais
    envolvidos em pesquisa
    17
    Quantidade de participantes
    envolvidos na pesquisa

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